유전자 가위 : 크리스퍼(CRISPR) 카스9(Cas9)

                    김진국

요약

 크리스퍼(CRISPR)는 DNA에서 절단하려는 특정 부분을 찾아 그 부분에 제한효소인 카스 9(Cas9)를 끌어들이는 역할을 하는 일종의 가이드 RNA이며 카스 9(Cas9)는 그 염기서열을 분해하여 절단하는 제한효소(Restriction endonucleases, 제한 핵산 내부 가수분해효소)이다.

1. 유전자, DNA, 게놈

 생명체에서 한 종류의 작용을 담당하는 유전정보를 유전자라 한다.
그런데 생명체에서 한 종류의 작용을 실제로 담당하는 물질은 단백질이다.  하나의 유전자는 한 종류의 단백질을 합성하는 정보이며 이 정보가 자손에게 전달되므로 유전자라 한다. 그래서 병을 일으키는 유전자를 제거하면 비정상 단백질 생성을 막을 수 있고 정상 유전자로 교체하면 정상 단백질이 합성되어 정상으로 작용할 수 있게 되는 것이다.
 유전의 최소 단위는 유전자(gene, 한 종류의 단백질을 합성하는 정보)이며 1개의 DNA에는 1000개 이상의 유전자가 결합되어 있다(염기로는 1억 개 이상 결합).
DNA가 히스톤 단백질 8량체(octamer)를 감는 구조인 뉴클레오솜(nucleosome)을 기본단위로 길게 연결되어 실처럼 길게 풀어진 상태로 세포의 핵 속에 있는데 이를 염색사라 한다. 체세포 분열을 할 때에는 복제된 염색사 두 가닥이 결합된 채로 꼬여서 실꾸리처럼 간단하게 되어야 분리되어 쉽게 양쪽 세포로 같은 양이 이동해 갈 수 있다. 세포분열을 할 때 염색사가 꼬여 짧게 된 것을 염색체라 한다.
세포 분열할 때 DNA를 중간에 끊어서 나누는 것이 아니고 분리되기 전에 두 배로 복제되며 각각의 가닥이 꼬여진 염색분체 2개로 붙어 있던 염색체(이분 염색체)가 염색분체로 분리되어 각각 새 세포로 이동한다. 이때 이분 염색체를 적도면에 배열하여 적도판을 형성하였다가 분리하므로 복제된 한 개의 염색체에서 분리된 두 개의 염색분체(염색체)가 같은 세포로 들어가지 않는 것이다.
그래서 한 개체의 모든 세포는 체세포 분열 때 유전체가 복제되어 분리되었으므로 모든 세포의 유전자는 동일하다.
우리 몸을 구성하고 있는 모든 세포는 동일하게 23종류 46개의 DNA(염색체)가 있다.
 한 종류의 생명체(한 개의 세포)가 가지고 있는 유전 정보 전체를 유전체(遺傳體) 혹은 게놈(genome)이라 하는데 게놈은 유전자(gene)와 염색체(chromosome)의 합성어이며 유전체는 게놈을 번역한 것이다.
사람의 유전체(게놈,  전체 DNA)는 약 32억 개의 염기(뉴클레오타이드) 쌍으로 구성되고 2만 5000개 정도의 유전자를 가지고 있다.
연속된 염기(뉴클레오타이드) 3개(트리플 넷)가 아미노산 한 종류를 지정하는 유전정보를 가진다.
어떤 한 종류의 단백질이 1,000개의 아미노산으로 구성되어 있다면 이 단백질을 결정하는 유전자는 3000개 이상의 염기(뉴클레오타이드)로 구성된다.

2. 연결 효소(ligase)와 제한효소(Restriction endonucleases, 제한 핵산 내부 가수분해효소)

1967년 DNA를 연결하여 결합시키는 연결 효소(ligase, 라이게이스, 리가아제)를 마틴 겔러트(Martin Frank Gellert, 1929 ~, 생화학자, 미국}와 로버트 레먼(Israel Robert Lehman, 1924 ~, 생화학자, 미국)이 분리하였다.
이어서 DNA를 절단하는 즉, 분해하는 효소를 제한효소라 하는데 1970년 스미스(Hamilton Otanel Smith, 1931 ~, 미생물학자, 미국)와 네이선스( Daniel Nathans, 1928 ~ 1999, 미생물학자, 미국)가 박테리아에서 발견하였다. 제한효소는 원래 세균이 바이러스나 외부 DNA의 침입에 대처하여 자신을 방어하는 수단으로 가지고 있는 효소다. 세균의 제한효소를 유전자 가위로 이용하는 것이다.
DNA는 단지 네 종류의 염기(뉴클레오타이드) 즉, 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C),  티민(A)으로 구성되어 있으며 A는 T, G는 C와 결합하는 쌍으로 존재한다. 이 간단한 DNA를 자르는 제한효소(초기의 유전자가위)의 종류에는 A, T, G, C의 네 종류의 염기 상호 간의 결합을 분해하는 효소로 16종류가 있다(예, A-C 사이를 자르는 효소).  
1개의 DNA가 1억 개의  염기로 결합되어 있다고 가정하고 한 종류의 제한효소로 분해시키면 1/16 억 조각이 생길 것이다.
유전체에서 내가 원하는 부분을 절단하기 위해 이런 유전자 가위로 분해시키면 의도한 부위뿐만 아니라 더 여러 군데를 절단함으로써 쓸 수 없는 유전자 조각을 만들거나 다른 유전자와 함께 길게 잘리는 등 많은 변이가 생겨날 수 있다.
그래서 이런 유전자 가위로는 작은 조각의 DNA 분해에는 유용하지만 게놈(유전체)에 적용할 수 없다는 한계가 있었다.
 이렇게 자른 유전자를 운반자에 결합시켜 운반하였다. 운반자로 세균의 플라스미드(plasmid, 박테리아 등에 있는 본 염색체 외의 별도의 유전체), 아그로박테리움(Agrobacterium, 토양 박테리아), 유전자 총(gene gun), 바이러스(virus) 등을 이용하였다.
이렇게 제한효소는 유전자 재조합 방법에 이용되었다.
유전자 재조합 방법은 1970년대 이후 개발되었으며 다른 종의 생물체 유전자를 잘라서 가져와 붙인 유전자 변형 생물(GMO)을 탄생시켰다.
유전자 변형 생물은 만들기도 어렵거니와 만들어진 생물체에 원하지 않는 다른 유전자도 같이 들어와 위험성을 내포하는 문제점을 가지고 있었다. 그 이유는 잘라 붙이는 방법이 부정확하기 때문이다.
 운반자로 플라스미드(plasmid)를 이용하는 유전자 재조합 예를 들어 보자.
어떤 생물 세포 DNA의 유전자를 절단하여 세균의 플라스미드에 붙인다고 하자.
세포에서 DNA를 분리하여 알맞은 제한효소와 함께 용액이 들어 있는 시험관에 넣어 DNA를 분해시킨다. 분자는 보이지 않으므로 필요한 유전자가 정확하게 분해되었는지는 알 수 없다. 원하는 유전자가 분해되어 있다고 가정하고 실험을 진행한다. 플라스미드도 같은 제한효소로 분해시킨 다음 두 가지를 합쳐 다른 시험관에 같이 넣고 결합 효소(ligase, 리가아제, 라이게이스)를 넣어서 플라스미드에 원하는 유전자를 결합시킨다. 마찬가지로 플라스미드도 원하는 부위에 절단되고 이것이 플라스미드에 결합되었다고 가정하고 실험을 진행한다.
이 플라스미드를 세균에 주입한다. 이 세균에서 삽입한 유전자의 형질이 발현되면 실험이 성공한 것이다.
제한효소(Restriction endonucleases, 제한 핵산 내부 가수분해효소)의 작용은 화학반응이고 유전자나 효소는 수㎛(마이크로미터, 100만 분의 1m) 정도로 작기 때문에 반응을 맨눈으로 확인할 수 없다. 실험의 성공을 확인하기 위해서는 실험으로 만들어진 여러 세균을 각각 분리 배양하여 원하는 유전자의 형질을 나타내는 개체를 찾는 것이다. 원하는 형질을 나타내는 세균이 없으면 실험을 처음부터 다시 하며 이렇게 수 없이 반복하다 보면 성공하게 되는 것이다.
이런 실험은 유전자 수가 적은 세균에서나 이용될 수 있으며 성공 확률이 낮고 성공해도 많은 문제가 발생할 수 있는 실험이란 것을 알 수 있다.
 그래도 유전자 재조합 초기에 과학자들은 제한효소를 이용했다.
DNA에 있는 모든 염기가 똑같은 비율로 규칙적으로 배열된 것은 아니므로 잘 디자인하여 적절한 제한효소를 적용하면 몇 백 개의 염기로 구성된 유전자를 다치지 않고 절단할 수도 있으며 경우에 따라서는 원하지 않은 다른 유전자가 포함된 가운데 절단되도록 디자인할 수밖에 없을 수도 있지만 어쨌든 원하는 유전자를 절단할 수는 있는 것이다.

3. 제1,  2세대 유전자 가위 

 어떤 단백질이 DNA의 특정한 염기서열 2~3개에 결합하는 것이 발견되었다. 이 단백질과 제한효소를 결합시켜 DNA의 특정한 부위를 절단하는 방법이 개발되었는데 이것이 제1, 2세대 유전자 가위이다.
제1세대 유전자 가위는 징크 핑거 뉴클레이스(ZFNs · Zinc Finger Nucleases), 제2세대 유전자 가위는 탈렌(TALENs · Transcription Activator-Like Effector Nucleases)이다.
 제1, 2세대의 유전자 가위는 단백질이 DNA 염기 서열을 4개에서 많게는 12개를 특이적으로 인식한다. 이런 유전자 가위를 사용해도 DNA에는 10개 정도의 염기서열이 같은 부위는 수 없이 많으므로 원하는 염기서열에서 뿐만 아니라 여러 부위를 절단할 수 있다. 염기 6개로 된 유전자 가위를 사용한다면 6자리이고 한자리에 4가지 염기가 올 수 있으므로 경우의 수는 4의 6승 즉 4096 종류의 가위를 만들 수 있다. 종류가 많다고 생각되지만 사람 유전체의 염기쌍 수는 32억 개이므로 4096으로 나누어 보면 78만 개의 조각으로 절단될 수 있는 것이다.
 그래도 과학자들은 절단되는 부위가 적게 되도록 계획하고 디자인하여 위험을 무릅쓰고 세포 속에 유전자 가위를 넣어서 목표로 하는 유전자를 절단하고자 하였다. 일부 성공하기도 하였다.
절단하고자 하는 유전자 부위 외에도 여러 부위에서 절단될지라도 우리 몸에는 유전자를 복구할 능력이 있으므로 발생되는 문제가 적을 수도 있기 때문이다.  더욱이 원하는 부분이 절단된 것도 원상태로 돌아갈 수도 있다. 제한효소(Restriction endonucleases, 제한 핵산 내부 가수분해효소)로 유전자를 절단하는 것은 일종의 확률 높은 돌연변이를 유도하는 것이다.
 상가모 연구진은 제1세대 유전자 가위인 ‘징크 핑거’로 에이즈 환자의 면역세포에서 CCR5 유전자를 제거한 뒤 다시 체내에 투여했다. 그 결과 환자의 체내에서 HIV의 번식과 HIV가 잠적해 있는 저장소가 모두 감소한 것으로 확인됐다.

4. 제3세대 유전자 가위 크리스퍼(CRISPR Cas9)

 이렇게 유전자 가위가 개발되어 감에 따라 사람의 유전병을 유발하는 유전자를 고치고자 하는 '유전자 치료(gene therapy)'를 꿈꾸기 시작하였다. 그러나 이 꿈이 실현되기 위해서는 유전자 가위가 정말 원하는 부분만을 자르는 특이성을 가져야 한다.
그러던 중 2012년 12월 제3세대 유전자 가위인 크리스퍼 카스 9(CRISPR Cas9) 기술이 개발되었다. 크리스퍼 카스 9(CRISPR Cas9)는 RNA가 DNA 염기서열의 특정 부위를 인식하여 결합하고 제한효소가 절단하는 방법이다.
크리스퍼 카스 9 기술(CRISPR Cas9)은 RNA가 DNA 염기서열 21개를 인식하여 결합하므로 정확도가 매우 높다.
제3세대 크리스퍼 카스 9 유전자 가위는 크리스퍼 카스 9 유전자 가위를 세포의 핵 속에 바로 넣어 유전체(게놈)를 절단할 수 있다. 아직은 단백질인 CAS9 효소(한국:Cpf1효소)가 너무 크기 때문에 막을 통과하기가 어려워 크기가 작은 효소를 찾고 있는 중이다. 우리나라 연구진은 현재 전기로  천공하여 크리스퍼 카스 9 유전자 가위를 세포 속으로 넣고 있다.
그래서 사람의 세포 속에 있는 32억 개의 DNA 염기쌍 중 의도하는 특정 유전자 염기 서열을 인식해 의도적으로 자르고 붙이고 고치는 유전체 교정(genome editing)의 가능성이 열린 것이다.
이 기술은 세균(박테리아)이 자신의 몸에 침입한 바이러스의 DNA를 절단하여 자신의 유전체에 저장하고 있다가 다음에 다시 같은 바이러스의 DNA가 침입하면 저장된 정보로 침입한 DNA 염기 서열을 인식해 바이러스의 DNA를 잘라서 무력화시키는 세균의 면역 작용에서 유래되었다.

5. 회문구조(palindrome)의 크리스퍼 유전자  발견

1980년대 말 스페인 블랑카 지역의 박사과정 학생이던 프란시스코 모히카(Francisco J. M. Mojica, 1963~ )가 강한 염분에 잘 견디는 해안가 박테리아 종의 유전체(게놈)를 연구하던 중 디엔에이(DNA)에서 독 툭하게 반복되는 염기서열 구조를 발견했다(출처:미국 생물학자 에릭 랜더)
또 다른 기록으로는 1987년 일본 과학자 요시즈미 이시노(石野 良純 , Ishino Yoshizumi, 1959~ )가 세균(박테리아)의 유전체를 연구하던 중 최초로 회문구조의 크리스퍼 유전자를 발견했다. 회문구조란 좌에서 우로 읽으나 우에서 좌로 읽으나 똑같은 것을 말한다(예 : ACTCGGCTCA, 여기서는 상보적 회문구조임 ACTCGTCGAGT). 처음 발견했을 때에는 이 유전자가 세균에서 어떤 기능을 하는지 알지 못했다. 1994년 세균의 염기 서열을 정밀 분석한 결과 모든 세균들이 크리스퍼 유전자를 가지고 있었고 크리스퍼 유전자에  연결되어 있는 바이러스의 염기 서열이 존재하는 것을 발견했다. 그리고 DNA에 회문 구조의 염기 서열이 반복적으로 나타난다는 영문 머리글자를 따서 크리스퍼(CRISPR, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, 간헐적으로 반복되는 회문 구조 염기 서열 집합체)라고 명명했다.

6. 크리스퍼(CRISPR)의 기능 규명

크리스퍼(CRISPR)의 기능을 규명한 사람은 DuPont의 덴마크 요구르트 회사 다니스코(DANISCO) 소속의 Rhodia Food에서 요구르트의 젖산균을 연구하던 프랑스 미생물학자 필리페 호바스(Philippe Horvath, 1970 ~ )라고 미국 생물학자 에릭 랜더는 기록하고 있다.
또 다른 기록으로는 2007년 DuPont의 덴마크 요구르트 회사 다니스코(DANISCO)의 연구원 로돌페 바랭구(Rodolphe Barrangou, 1975 ~ , 프랑스) 등에 의해 크리스퍼의 기능이 최초로 규명되었다고 한다. 우유를 요구르트로 발효시키는 유산균(세균)은 바이러스(박테리오파지) 감염에 취약한데, 어떤 특정한 유산균이 바이러스에 내성을 가진 것을 발견하였다. 바이러스에 내성을 가지는 유산균의 게놈을 분석해 본 결과, 크리스퍼 유전자들이 활성화되어 있는 것을 발견했으며 유산균을 공격하는 바이러스(박테리오파지)의 유전자 염기 서열이 세균의 크리스퍼 유전자에 연결되어 있는 것도 발견하였다.
이것으로 세균(박테리아)에서도 크리스퍼 유전자가 면역 기능을 하고 있는 것으로 밝혀진 것이다.

7. 크리스퍼(CRISPR) 작동 메커니즘 규명

2012년 버클리 대학교의 제니퍼 다우드나(Jennifer A. Doudna, 1964~  미국, 2020년 노벨화학상 수상)와 스웨덴 우메어 대학교의 엠마뉴엘 카펜디어(Emmanuelle Charpentier, 에마뉘엘 샤르팡티에, 1968~, 프랑스, 2020년 노벨화학상 수상)는 크리스퍼의 작동 메커니즘을 상세히 규명하였다.
그 내용을 간단히 정리하면 다음과 같다.
세균(박테리아)은 박테리오파지(바이러스)의 DNA가 침입하면 카스 9(Cas9) 유전자로 제한효소(Restriction endonucleases, 제한 핵산 내부 가수분해효소, restriction endonuclease)인 카스 9(Cas9)를 합성하여 침입한 박테리오파지(바이러스)의 DNA 중 21쌍의 염기서열(21bp)을 절단하여 세균 자신 DNA의 크리스퍼(회문구조) 유전자에 결합시켜 저장한다. 세균은 박테리오파지의 DNA가 다시 침입하면 그에 대한 반응으로 크리스퍼 유전자와 연결된 파지 염기서열  두 가지 모두를 하나의 RNA로 전사한다. 이를 gRNA(가이드 RNA)라 한다. 이어서 gRNA(가이드 RNA)와 카스 9(Cas9) 제한효소가 결합하여 박테리오파지(바이러스) DNA 중 절단할 부위를 찾아 카스 9(Cas9) 제한효소를 유도한다. gRNA(가이드 RNA)의 회문구조는 저들끼리 결합하여 고리를 이룬다. 그다음 침입한 박테리오파지 DNA 이중나선의 수소결합 일부를 끊고 그 사이로 gRNA(가이드 RNA)의  박테리오파지(바이러스) 21쌍의 염기서열을 삽입하여 결합한다.  gRNA(가이드 RNA)에 결합된 카스 9(Cas9) 제한효소가 작용하여 박테리오파지(바이러스)의 21쌍의 염기서열 중 18번째 염기 부위에 해당하는 박테리오파지(바이러스) DNA의 양쪽 가닥 모두가 절단된다.
이 연구 과정에서 다우드나와 카펜디어는 박테리오파지의 염기 서열은 21bp 길이로 잘려 크리스퍼 유전자(DNA) 내에 보관되었다가 세균이 다시 침입하면 전사되어 가이드 RNA로 사용되는데, 박테리오파지의 염기 서열이 아닌 다른 임의의 21bp 길이의 염기 서열을 크리스퍼 RNA에 연결하여 삽입해도 이 시스템이 정상적으로 작동하여 DNA를 절단하는 것을 확인하였다.
이러한 발견으로 크리스퍼는 기존의 효율성과 특이성이 떨어져 유전체에 사용하기 어려웠던 유전자 가위를 대치할 수 있는 새로운 유전자 가위가 되었다.
기존 유전자 가위들이 적게는 4개 많게는 12개 정도의 염기 서열을 인식하기에 유전체에 사용했을 경우 일치하는 부분이 많이 있을 수 있으므로 원하는 부분이 아니라도 같은 염기서열로 인식되어 절단되므로 오류 가능성이 높았다면, 크리스퍼는 21개의 염기 서열을 인식하기 때문에 유전체 내에서 21개의 염기 서열이 정확하게 일치하는 부분이 여럿일 가능성은 매우 낮다. 4의 21승 즉 4.4 × 10의 12승 종류의 유전자 가위가 가능하다. 그래서 크리스퍼의 경우 사람의 유전체에서 오류가 발생할 확률이 3.2 × 10의 9승을 4.4 × 10의 12승으로 나누면 1만 분의 7로 다른 유전자 가위 기술과 비교 불가능하게 그 오류 가능성이 낮아진다.  크리스퍼가 의도치 않은 부분의 유전자를 잘못 절단할 가능성은 거의 없다는 결론에 도달하게 된다. 제1, 2세대 유전자 가위는 인식하는 염기서열 수가 적어서 인식하는 염기서열 개수를 늘리기 위해 염기서열 여러 개를 붙여서 만드는데 어렵고 비용이 많이 들며 절단 부위가 많아 부정확하지만 크리스퍼는 작은 RNA로 DNA의 절단 부위를 정확히 찾고 제한효소로 그 부위를 절단하는 것이다. 그래서 과거 제1, 2세대 유전자 가위로는 유전자 하나를 잘라내고 새로 바꾸는 데 수개월에서 수년씩 걸리던 것이 크리스퍼를 통해 며칠이면 되고, 한 번에 여러 군데의 유전자를 동시에 처리할 수 있게 될 것이다. 게놈(유전체)에서 정확하게 원하는 부위를  잘라 내거나 원하는 다른 것으로 교체할 수 있는 도구를 찾게 된 것이다.
 현재 개발된 크리스퍼 카스 9 가위는 만능이 아니다. 이론과는 달리 실제에는 한 곳에서만 절단되기도 하지만 여러  곳에서 절단되고 있다. 그래서 먼저 정확성을 높여야 한다. 크리스퍼 카스 9 가위는 가위질에 서툰 사람처럼 원하지 않는 부위도 잘라낸다. 이를 '오프 타깃 사이트(off-target site)'라 부른다.
그리고 원치 않는 유전자 변이를 억제하는 연구도 앞으로 남은 중요한 과제이다.  
유전자를 절단하여 기능을 잃게 하는 것은 지금도 가능하지만 다른 유전자를 삽입하는 것은 더 많은 연구와 시간이 걸릴 것이다.
최근에는 크리스퍼 카스 9 가위의 원하지 않은 부분의 작용을 복구하는 스토퍼라고 하는 복구 효소를 찾았다고 하며 우리나라 공동연구진은 gRNA 끝에 구아닌(G) 염기를 하나 더 붙여 정확성을 높였다고 한다.
단백질인 CAS9 효소(한국:Cpf1효소)가 너무 크기 때문에 막을 통과하기가 어려워 크기가 작은 효소를 찾고 있는 중이다.
그리고 원조의 버클리대,  MIT,  우리나라의 김진수 박사가 이끄는  톨젠, IBS 등의 공동 팀 간에 특허권 분쟁이 일어나 소송이 벌어지고 있다.

8. 유전자 전달(遺傳子傳達, gene trasfer) 방법

가. 세균의 플라스미드(plasmid) 이용법
세균의 플라스미드(plasmid, 박테리아 등에 있는 본 염색체 외의 별도의 유전체)에 유전자를 연결시켜 운반하는 방법이다.

나. 인산칼슘 형질 주입(calcium phosphate trans-fection)
DNA-인산칼슘 용액을 배양세포에 넣으면 DNA-인산칼슘이 세포의 식세포 작용(食細胞作用, phagocytosis)에 의해 운반된다.

다. 유전자총 법(particle gun, Biolistic transformation)
핵산으로 도포된 금속입자를 가스압(력) 또는 자력(磁力)으로 세포 또는 조직에 주입시키는  방법이다.

라. 아그로박테리움(Agrobacterium, 토양 박테리아) 이용법
아그로박테리움은 식물의 상처 난 곳에 침입하며 Ti Plasmid(tumor inducing plasmid)라는 핵산 단백질 형태로 자신의 T-DNA((transfer DNA)를 식물체의 염색체에 삽입되는 것을 이용한다.

마. 프로토플라스트(protoplast) 이용법
식물세포의 세포벽을 제거하여 세포벽이 없는 상태(protoplast, 프로토플라스트)를 만들고 이 상태에서 원하는 DNA를 주입하여 유전자 변형 식물을 생성하는 방법이다.

바. 마이크로 피펫(micropipette) 이용법
마이크로 피펫(micropipette, 미세 피펫)을 사용하여 세포핵에 DNA를 주입하는 방법이다.

사. 바이러스 벡터(retrovirus vector) 이용법
유전자 치료를 위하여 레트로바이러스(retrovirus) 또는 아데노바이러스를 이용한 전달 시스템을 개발하였다.  
그런데 바이러스 벡터는 안전과 관련된 여러 문제점이 발견되었다.

아. 파열적 혈구(Ghost Red Blood Cell, Erythrocyte ghost-mediated gene delivery)  이용법
적혈구를 소변(urine)에 넣어 세포막을 파열시켜 세포막과 유리 헤모글로빈만 남은 파열적 혈구(Ghost red blood cell)에 전기천공으로 플라스미드 DNA을 삽입하여 혈액에 넣으면 혈액 세포를 표적으로 하는 유전자를 발현할 수 있다.

자. 리포솜 이용법(lipofection 법)  세포막과 구조가 같은 인지질 이중막을 만들어 그 속에 물질을 넣고 엔도시토시스(내포 작용)로 리포솜을 세포막에 융합시켜 물질을 세포 속으로 넣는다.

차. 전기천공법(electroporation)
세포막에 전기 충격을 주면 물질 투과성이 증대되어 몇 초에서 몇 분간 그 상태가 유지될 수 있으므로 직접 세포막을 투과할 수 없는 물질까지도 침투가 가능하게 된다.

타. 덴드리머(Dendrimer) 이용법
나뭇가지 모양의 고분자로 중심이 비어 있고 외부는 다양한 화학 단위와 반응할 수 있는 반응기가 존재하므로 주위의 건강한 조직을 다치지 않고도 원하는 의약을 감염 부위나 종양 부위에 선택적으로 전달할 수 있어 유전적 결함을 치료하는 데 사용된다.
그중에서 양이온성 고분자의 일종인 가지형 폴리에틸렌이민(BPEI)은 화학적 수정이 쉽고 뛰어난 유전자 전달 능력을 갖추고 있으므로 전도 유망한 비 바이러스성 전달체로 간주하고 있다.

카. TAT protein(Trans-Activator of Transcription) 이용법
Human immuno deficiency virus(HIV, 에이즈 바이러스)에서 유래된 TAT protein은 단백질을 세포 내로 침투시키는 능력이 있다고 알려져 있다. 정확한 기작은 아직 밝혀진 바 없지만 receptor나 transporter에 의존하지 않고 직접 세포막에 작용하여 세포 내로 침투한다고 추정되고 있다. TAT protein 전체나 특정 부분이 ovalbumin, horse radish peroxidase, beta-galactosidase 등의 단백질뿐만 아니라 nucleic acld, nano particle, liposome과 같은 고분자 물질을 세포 내로 침투시킬 수 있음이 여러 연구자들의 실험을 통해 입증되었고, 따라서 이와 같은 시도들은 세포 내 단백질 침투 기술을 이용한 질병 치료의 가능성을 제시하였다. Protein transduction domain을 생리 활성이 뛰어난 목표 단백질에 재조합 단백질 제조기술을 이용하여 융합하고 세포나 조직 내로 침투시켜 질병의 치료나 특정 증상의 완화를 목표로 하는 시도는 다양한 단백질에 transduction domain을 적용할 수 있다는 연구결과에 의해 그 가능성이 더욱 증가하였다.

9. 유전자 가위(크리스퍼 카스 9) 적용 사례

 크리스퍼 카스 9 가위 하나를 만드는 비용은 1000달러에 불과하다. 저렴한 만큼 연구가 여러 곳에서 많이 이루어져 발전 속도가 빠르고 응용분야도 넓다. 고부가가치 농작물이나 줄기세포를 활용한 유전자 치료 등에서도 관련 연구가 진행되고 있다.

가. 피가 응고되지 않는 혈우병을 치료하기 위해 혈우병 환자  본인의 돌연변이 세포를  이용해 역분화 줄기세포(iPS)를 만든 뒤 혈우병을 일으키는 원인 유전자를 ‘유전자 가위’로 교정, 정상적인 세포로 분화시켜 혈우병에 걸린 쥐에 이식해 생존기간을 늘리는 데 성공했다.

나. 중국 광저우 의대에서는 수정란에 ‘유전자 가위’ 기술을 적용해 에이즈 바이러스(HIV)에 내성을 갖는 배아를 만들었다. 26개의 인간 배아에 유전자 가위 기술을 활용해 혈액세포 유전자(CCR5)를 제거하는 데 성공했다. CCR5는 에이즈 바이러스(HIV)와 달라붙어 세포 속으로 HIV 바이러스를 이동시키는 역할을 한다. 이 때문에 CCR5를 제거하면 HIV에 감염되지 않는다.
에이즈 환자를 치료하는 것이 아니고 태어나는 아기에 적용해 본 거이다. 이것도 성공할지는 기다려 보아야 한다.

다. 한미 합동 연구팀은 면역결핍 형질전환 복제돼지를 생산하는 데 성공했다. 이번에 개발된 돼지는 ‘유전자 가위’를 이용해 면역 관련 유전자를 완전히 제거시킨 형질전환 복제돼지로, 인간과 매우 유사한 면역체계를 가지고 있어 줄기세포 치료 때 세포치료의 안전성, 만능성, 분화 가능성을 조기에 확인할 수 있어 치료 성공률을 높일 수 있다.

라. 영국에서는 크리스퍼 카스 9 기술을 이용해 돼지의 감염과 관련된 유전자를 흑 멧돼지의 유전자로 교체해 아프리카 돼지의 열병을 치료하였다.

마. 호주에서는 달걀 알레르기를 해결하기 위해 크리스퍼 카스 9를 활용했다. 닭의 원시 생식세포(정자나 난자 어느 쪽으로도 변할 수 있는 미성숙 세포)를 수정할 수 있는 방법을 개발해 알레르기를 없앤 달걀의 개발 가능성을 열었다.

바. 유전자 조작 식품(GMO)의 유해성 논란도 줄어들 것이다. 현재 만들고 있는 GMO는 식물 세균인 ‘아그로박테리움’을 활용해 외부 유전자를 식물에 인위적으로 삽입하는 유전자 재조합 방법을 이용한다. 이 과정에서 목표로 하는 유전자뿐만 아니라 수백, 수천 개가 넘는 외부 유전자가 같이 삽입돼 안전성 문제가 생길 수 있다.
유전자 가위에 쓰이는 RNA는 오직 목표 DNA에만 상보적으로 결합해 불활성화시키므로 정확성 또한 뛰어나다. RNA를 도입한다는 점에서 GM 기술과 달리 세포 내 DNA가 잔류 할리도 만무하다. 때문에 ‘유전자 가위’는 GMO의 부작용을 최소화할 수 있다.  

사. 멸종 동물들의 복원에도 연구가 진행되고 있다. 미국 하버드 의대 연구진이 이끄는 연구진은 인도코끼리를 변형해 추위에서도 잘 살아남는 코끼리를 만든 뒤 시베리아에 방출할 계획을 세우고 있다.
미국 캘리포니아대에선 19세기에 소멸된 여행 비둘기를 부활시키기 위해 박물관에 보관된 여행 비둘기의 DNA와 현대 비둘기의 DNA를 비교하는 작업이 진행 중이다.

10. 윤리적 논쟁

 유전자 가위를 활용한 유전자 조작 기술이 발전함에 따라 생명윤리에 대한 우려도 함께 커지고 있다.
황쥔주 등 중산대 연구팀은 인공 수정란의 빈혈 유발 유전자를 정상 유전자로 바꿔치기했다고 발표해 일부 과학자가 ‘크리스퍼 카스 9 연구 중단(모라토리움)’ 선언을 촉구하는 등 논쟁을 일으켰다.
 미국 재생의학을 위한 연합 의장인 에드워드 랜피어 박사 등 네 명의 저명한 과학자는 유전자 가위를 활용한 인간배아 연구를 중단해야 한다고 네이처(Nature)지 기고를 통해 밝혔다. 미국 노벨상 수상자인 데이비드 볼티모어와 폴 버그 박사는 최근 월스트리트 저널(WSJ) 기고에서 “과학계가 기술과 윤리적 차원에서 우리 행동의 신중하게 생각해야 한다"라며 “지금은 유전자를 편집하기 전에 잠시 멈춰 생각할 시간”이라고 호소했다. 저명한 생화학자이자 국제줄기세포 연구 학회(ISSCR) 회장인 루돌프 재니쉬도 타임 기고를 통해 이 같은 움직임에 동참했다.
 우리 정부도 국가 과학기술심의회에서 사람을 대상으로 한 치료에 유전자 가위를 적용하기 위해서는 추가 연구와 안전성에 대한 검증이 필요며 인간 배아에 유전자 가위를 적용하는 문제에 대해서도 사회적 합의를 모으기로 하는 등 유전자 연구에 크리스퍼 카스 9를 사용하는데 소극적이다.

11. 각 국 정부의 허가 사항

2006년 유럽연합(EU)은 유전자 편집 염소를 이용해 항응고 단백질이 포함된 우유 생산을 허가했으며, 2009년 미국 식품의약국(FDA)도 이를 허가했다. 양 기관은 지난해 콜레스테롤 약물에 유전자 편집 닭이 생산한 달걀을 포함하는 것을 허가하기도 했다.
인간의 수정란에서 유전자 일부를 잘라내고 편집하는 실험이 영국에서 승인됐다. 국가기관의 승인을 받아 공식으로 실험하는 것은 이번이 처음이다.
 크리스퍼(CRISPR)는 DNA에서 절단하려는 특정 부분을 찾아 그 부분에 제한효소인 카스 9(Cas9)를 끌어들이는 역할을 하는 일종의 가이드 RNA이며 카스 9(Cas9)는 그 염기서열을 분해하여 절단하는 제한효소(Restriction endonucleases, 제한 핵산 내부 가수분해효소)이다.

1. 유전자, DNA, 게놈

 생명체에서 한 종류의 작용을 담당하는 유전정보를 유전자라 한다.
그런데 생명체에서 한 종류의 작용을 실제로 담당하는 물질은 단백질이다.  하나의 유전자는 한 종류의 단백질을 합성하는 정보이며 이 정보가 자손에게 전달되므로 유전자라 한다. 그래서 병을 일으키는 유전자를 제거하면 비정상 단백질 생성을 막을 수 있고 정상 유전자로 교체하면 정상 단백질이 합성되어 정상으로 작용할 수 있게 되는 것이다.
 유전의 최소 단위는 유전자(gene, 한 종류의 단백질을 합성하는 정보)이며 1개의 DNA에는 1000개 이상의 유전자가 결합되어 있다(염기로는 1억 개 이상 결합).
DNA가 히스톤 단백질 8량체(octamer)를 감는 구조인 뉴클레오솜(nucleosome)을 기본단위로 길게 연결되어 실처럼 길게 풀어진 상태로 세포의 핵 속에 있는데 이를 염색사라 한다. 체세포 분열을 할 때에는 복제된 염색사 두 가닥이 결합된 채로 꼬여서 실꾸리처럼 간단하게 되어야 분리되어 쉽게 양쪽 세포로 같은 양이 이동해 갈 수 있다. 세포분열을 할 때 염색사가 꼬여 짧게 된 것을 염색체라 한다.
세포 분열할 때 DNA를 중간에 끊어서 나누는 것이 아니고 분리되기 전에 두 배로 복제되며 각각의 가닥이 꼬여진 염색분체 2개로 붙어 있던 염색체(이분 염색체)가 염색분체로 분리되어 각각 새 세포로 이동한다. 이때 이분 염색체를 적도면에 배열하여 적도판을 형성하였다가 분리하므로 복제된 한 개의 염색체에서 분리된 두 개의 염색분체(염색체)가 같은 세포로 들어가지 않는 것이다.
그래서 한 개체의 모든 세포는 체세포 분열 때 유전체가 복제되어 분리되었으므로 모든 세포의 유전자는 동일하다.
우리 몸을 구성하고 있는 모든 세포는 동일하게 23종류 46개의 DNA(염색체)가 있다.
 한 종류의 생명체(한 개의 세포)가 가지고 있는 유전 정보 전체를 유전체(遺傳體) 혹은 게놈(genome)이라 하는데 게놈은 유전자(gene)와 염색체(chromosome)의 합성어이며 유전체는 게놈을 번역한 것이다.
사람의 유전체(게놈,  전체 DNA)는 약 32억 개의 염기(뉴클레오타이드) 쌍으로 구성되고 2만 5000개 정도의 유전자를 가지고 있다.
연속된 염기(뉴클레오타이드) 3개(트리플 넷)가 아미노산 한 종류를 지정하는 유전정보를 가진다.
어떤 한 종류의 단백질이 1,000개의 아미노산으로 구성되어 있다면 이 단백질을 결정하는 유전자는 3000개 이상의 염기(뉴클레오타이드)로 구성된다.

2. 연결 효소(ligase)와 제한효소(Restriction endonucleases, 제한 핵산 내부 가수분해효소)

1967년 DNA를 연결하여 결합시키는 연결 효소(ligase, 라이게이스, 리가아제)를 마틴 겔러트(Martin Frank Gellert, 1929 ~, 생화학자, 미국}와 로버트 레먼(Israel Robert Lehman, 1924 ~, 생화학자, 미국)이 분리하였다.
이어서 DNA를 절단하는 즉, 분해하는 효소를 제한효소라 하는데 1970년 스미스(Hamilton Otanel Smith, 1931 ~, 미생물학자, 미국)와 네이선스( Daniel Nathans, 1928 ~ 1999, 미생물학자, 미국)가 박테리아에서 발견하였다. 제한효소는 원래 세균이 바이러스나 외부 DNA의 침입에 대처하여 자신을 방어하는 수단으로 가지고 있는 효소다. 세균의 제한효소를 유전자 가위로 이용하는 것이다.
DNA는 단지 네 종류의 염기(뉴클레오타이드) 즉, 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C),  티민(A)으로 구성되어 있으며 A는 T, G는 C와 결합하는 쌍으로 존재한다. 이 간단한 DNA를 자르는 제한효소(초기의 유전자가위)의 종류에는 A, T, G, C의 네 종류의 염기 상호 간의 결합을 분해하는 효소로 16종류가 있다(예, A-C 사이를 자르는 효소).  
1개의 DNA가 1억 개의  염기로 결합되어 있다고 가정하고 한 종류의 제한효소로 분해시키면 1/16 억 조각이 생길 것이다.
유전체에서 내가 원하는 부분을 절단하기 위해 이런 유전자 가위로 분해시키면 의도한 부위뿐만 아니라 더 여러 군데를 절단함으로써 쓸 수 없는 유전자 조각을 만들거나 다른 유전자와 함께 길게 잘리는 등 많은 변이가 생겨날 수 있다.
그래서 이런 유전자 가위로는 작은 조각의 DNA 분해에는 유용하지만 게놈(유전체)에 적용할 수 없다는 한계가 있었다.
 이렇게 자른 유전자를 운반자에 결합시켜 운반하였다. 운반자로 세균의 플라스미드(plasmid, 박테리아 등에 있는 본 염색체 외의 별도의 유전체), 아그로박테리움(Agrobacterium, 토양 박테리아), 유전자 총(gene gun), 바이러스(virus) 등을 이용하였다.
이렇게 제한효소는 유전자 재조합 방법에 이용되었다.
유전자 재조합 방법은 1970년대 이후 개발되었으며 다른 종의 생물체 유전자를 잘라서 가져와 붙인 유전자 변형 생물(GMO)을 탄생시켰다.
유전자 변형 생물은 만들기도 어렵거니와 만들어진 생물체에 원하지 않는 다른 유전자도 같이 들어와 위험성을 내포하는 문제점을 가지고 있었다. 그 이유는 잘라 붙이는 방법이 부정확하기 때문이다.
 운반자로 플라스미드(plasmid)를 이용하는 유전자 재조합 예를 들어 보자.
어떤 생물 세포 DNA의 유전자를 절단하여 세균의 플라스미드에 붙인다고 하자.
세포에서 DNA를 분리하여 알맞은 제한효소와 함께 용액이 들어 있는 시험관에 넣어 DNA를 분해시킨다. 분자는 보이지 않으므로 필요한 유전자가 정확하게 분해되었는지는 알 수 없다. 원하는 유전자가 분해되어 있다고 가정하고 실험을 진행한다. 플라스미드도 같은 제한효소로 분해시킨 다음 두 가지를 합쳐 다른 시험관에 같이 넣고 결합 효소(ligase, 리가아제, 라이게이스)를 넣어서 플라스미드에 원하는 유전자를 결합시킨다. 마찬가지로 플라스미드도 원하는 부위에 절단되고 이것이 플라스미드에 결합되었다고 가정하고 실험을 진행한다.
이 플라스미드를 세균에 주입한다. 이 세균에서 삽입한 유전자의 형질이 발현되면 실험이 성공한 것이다.
제한효소(Restriction endonucleases, 제한 핵산 내부 가수분해효소)의 작용은 화학반응이고 유전자나 효소는 수㎛(마이크로미터, 100만 분의 1m) 정도로 작기 때문에 반응을 맨눈으로 확인할 수 없다. 실험의 성공을 확인하기 위해서는 실험으로 만들어진 여러 세균을 각각 분리 배양하여 원하는 유전자의 형질을 나타내는 개체를 찾는 것이다. 원하는 형질을 나타내는 세균이 없으면 실험을 처음부터 다시 하며 이렇게 수 없이 반복하다 보면 성공하게 되는 것이다.
이런 실험은 유전자 수가 적은 세균에서나 이용될 수 있으며 성공 확률이 낮고 성공해도 많은 문제가 발생할 수 있는 실험이란 것을 알 수 있다.
 그래도 유전자 재조합 초기에 과학자들은 제한효소를 이용했다.
DNA에 있는 모든 염기가 똑같은 비율로 규칙적으로 배열된 것은 아니므로 잘 디자인하여 적절한 제한효소를 적용하면 몇 백 개의 염기로 구성된 유전자를 다치지 않고 절단할 수도 있으며 경우에 따라서는 원하지 않은 다른 유전자가 포함된 가운데 절단되도록 디자인할 수밖에 없을 수도 있지만 어쨌든 원하는 유전자를 절단할 수는 있는 것이다.

3. 제1,  2세대 유전자 가위 

 어떤 단백질이 DNA의 특정한 염기서열 2~3개에 결합하는 것이 발견되었다. 이 단백질과 제한효소를 결합시켜 DNA의 특정한 부위를 절단하는 방법이 개발되었는데 이것이 제1, 2세대 유전자 가위이다.
제1세대 유전자 가위는 징크 핑거 뉴클레이스(ZFNs · Zinc Finger Nucleases), 제2세대 유전자 가위는 탈렌(TALENs · Transcription Activator-Like Effector Nucleases)이다.
 제1, 2세대의 유전자 가위는 단백질이 DNA 염기 서열을 4개에서 많게는 12개를 특이적으로 인식한다. 이런 유전자 가위를 사용해도 DNA에는 10개 정도의 염기서열이 같은 부위는 수 없이 많으므로 원하는 염기서열에서 뿐만 아니라 여러 부위를 절단할 수 있다. 염기 6개로 된 유전자 가위를 사용한다면 6자리이고 한자리에 4가지 염기가 올 수 있으므로 경우의 수는 4의 6승 즉 4096 종류의 가위를 만들 수 있다. 종류가 많다고 생각되지만 사람 유전체의 염기쌍 수는 32억 개이므로 4096으로 나누어 보면 78만 개의 조각으로 절단될 수 있는 것이다.
 그래도 과학자들은 절단되는 부위가 적게 되도록 계획하고 디자인하여 위험을 무릅쓰고 세포 속에 유전자 가위를 넣어서 목표로 하는 유전자를 절단하고자 하였다. 일부 성공하기도 하였다.
절단하고자 하는 유전자 부위 외에도 여러 부위에서 절단될지라도 우리 몸에는 유전자를 복구할 능력이 있으므로 발생되는 문제가 적을 수도 있기 때문이다.  더욱이 원하는 부분이 절단된 것도 원상태로 돌아갈 수도 있다. 제한효소(Restriction endonucleases, 제한 핵산 내부 가수분해효소)로 유전자를 절단하는 것은 일종의 확률 높은 돌연변이를 유도하는 것이다.
 상가모 연구진은 제1세대 유전자 가위인 ‘징크 핑거’로 에이즈 환자의 면역세포에서 CCR5 유전자를 제거한 뒤 다시 체내에 투여했다. 그 결과 환자의 체내에서 HIV의 번식과 HIV가 잠적해 있는 저장소가 모두 감소한 것으로 확인됐다.

4. 제3세대 유전자 가위 크리스퍼(CRISPR Cas9)

 이렇게 유전자 가위가 개발되어 감에 따라 사람의 유전병을 유발하는 유전자를 고치고자 하는 '유전자 치료(gene therapy)'를 꿈꾸기 시작하였다. 그러나 이 꿈이 실현되기 위해서는 유전자 가위가 정말 원하는 부분만을 자르는 특이성을 가져야 한다.
그러던 중 2012년 12월 제3세대 유전자 가위인 크리스퍼 카스 9(CRISPR Cas9) 기술이 개발되었다. 크리스퍼 카스 9(CRISPR Cas9)는 RNA가 DNA 염기서열의 특정 부위를 인식하여 결합하고 제한효소가 절단하는 방법이다.
크리스퍼 카스 9 기술(CRISPR Cas9)은 RNA가 DNA 염기서열 21개를 인식하여 결합하므로 정확도가 매우 높다.
제3세대 크리스퍼 카스 9 유전자 가위는 크리스퍼 카스 9 유전자 가위를 세포의 핵 속에 바로 넣어 유전체(게놈)를 절단할 수 있다. 아직은 단백질인 CAS9 효소(한국:Cpf1효소)가 너무 크기 때문에 막을 통과하기가 어려워 크기가 작은 효소를 찾고 있는 중이다. 우리나라 연구진은 현재 전기로  천공하여 크리스퍼 카스 9 유전자 가위를 세포 속으로 넣고 있다.
그래서 사람의 세포 속에 있는 32억 개의 DNA 염기쌍 중 의도하는 특정 유전자 염기 서열을 인식해 의도적으로 자르고 붙이고 고치는 유전체 교정(genome editing)의 가능성이 열린 것이다.
이 기술은 세균(박테리아)이 자신의 몸에 침입한 바이러스의 DNA를 절단하여 자신의 유전체에 저장하고 있다가 다음에 다시 같은 바이러스의 DNA가 침입하면 저장된 정보로 침입한 DNA 염기 서열을 인식해 바이러스의 DNA를 잘라서 무력화시키는 세균의 면역 작용에서 유래되었다.

5. 회문구조(palindrome)의 크리스퍼 유전자  발견

1980년대 말 스페인 블랑카 지역의 박사과정 학생이던 프란시스코 모히카(Francisco J. M. Mojica, 1963~ )가 강한 염분에 잘 견디는 해안가 박테리아 종의 유전체(게놈)를 연구하던 중 디엔에이(DNA)에서 독 툭하게 반복되는 염기서열 구조를 발견했다(출처:미국 생물학자 에릭 랜더)
또 다른 기록으로는 1987년 일본 과학자 요시즈미 이시노(石野 良純 , Ishino Yoshizumi, 1959~ )가 세균(박테리아)의 유전체를 연구하던 중 최초로 회문구조의 크리스퍼 유전자를 발견했다. 회문구조란 좌에서 우로 읽으나 우에서 좌로 읽으나 똑같은 것을 말한다(예 : ACTCGGCTCA, 여기서는 상보적 회문구조임 ACTCGTCGAGT). 처음 발견했을 때에는 이 유전자가 세균에서 어떤 기능을 하는지 알지 못했다. 1994년 세균의 염기 서열을 정밀 분석한 결과 모든 세균들이 크리스퍼 유전자를 가지고 있었고 크리스퍼 유전자에  연결되어 있는 바이러스의 염기 서열이 존재하는 것을 발견했다. 그리고 DNA에 회문 구조의 염기 서열이 반복적으로 나타난다는 영문 머리글자를 따서 크리스퍼(CRISPR, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, 간헐적으로 반복되는 회문 구조 염기 서열 집합체)라고 명명했다.

6. 크리스퍼(CRISPR)의 기능 규명

크리스퍼(CRISPR)의 기능을 규명한 사람은 DuPont의 덴마크 요구르트 회사 다니스코(DANISCO) 소속의 Rhodia Food에서 요구르트의 젖산균을 연구하던 프랑스 미생물학자 필리페 호바스(Philippe Horvath, 1970 ~ )라고 미국 생물학자 에릭 랜더는 기록하고 있다.
또 다른 기록으로는 2007년 DuPont의 덴마크 요구르트 회사 다니스코(DANISCO)의 연구원 로돌페 바랭구(Rodolphe Barrangou, 1975 ~ , 프랑스) 등에 의해 크리스퍼의 기능이 최초로 규명되었다고 한다. 우유를 요구르트로 발효시키는 유산균(세균)은 바이러스(박테리오파지) 감염에 취약한데, 어떤 특정한 유산균이 바이러스에 내성을 가진 것을 발견하였다. 바이러스에 내성을 가지는 유산균의 게놈을 분석해 본 결과, 크리스퍼 유전자들이 활성화되어 있는 것을 발견했으며 유산균을 공격하는 바이러스(박테리오파지)의 유전자 염기 서열이 세균의 크리스퍼 유전자에 연결되어 있는 것도 발견하였다.
이것으로 세균(박테리아)에서도 크리스퍼 유전자가 면역 기능을 하고 있는 것으로 밝혀진 것이다.

7. 크리스퍼(CRISPR) 작동 메커니즘 규명

2012년 버클리 대학교의 제니퍼 다우드나(Jennifer A. Doudna, 1964~  미국, 2020년 노벨화학상 수상)와 스웨덴 우메어 대학교의 엠마뉴엘 카펜디어(Emmanuelle Charpentier, 에마뉘엘 샤르팡티에, 1968~, 프랑스, 2020년 노벨화학상 수상)는 크리스퍼의 작동 메커니즘을 상세히 규명하였다.
그 내용을 간단히 정리하면 다음과 같다.
세균(박테리아)은 박테리오파지(바이러스)의 DNA가 침입하면 카스 9(Cas9) 유전자로 제한효소(Restriction endonucleases, 제한 핵산 내부 가수분해효소, restriction endonuclease)인 카스 9(Cas9)를 합성하여 침입한 박테리오파지(바이러스)의 DNA 중 21쌍의 염기서열(21bp)을 절단하여 세균 자신 DNA의 크리스퍼(회문구조) 유전자에 결합시켜 저장한다. 세균은 박테리오파지의 DNA가 다시 침입하면 그에 대한 반응으로 크리스퍼 유전자와 연결된 파지 염기서열  두 가지 모두를 하나의 RNA로 전사한다. 이를 gRNA(가이드 RNA)라 한다. 이어서 gRNA(가이드 RNA)와 카스 9(Cas9) 제한효소가 결합하여 박테리오파지(바이러스) DNA 중 절단할 부위를 찾아 카스 9(Cas9) 제한효소를 유도한다. gRNA(가이드 RNA)의 회문구조는 저들끼리 결합하여 고리를 이룬다. 그다음 침입한 박테리오파지 DNA 이중나선의 수소결합 일부를 끊고 그 사이로 gRNA(가이드 RNA)의  박테리오파지(바이러스) 21쌍의 염기서열을 삽입하여 결합한다.  gRNA(가이드 RNA)에 결합된 카스 9(Cas9) 제한효소가 작용하여 박테리오파지(바이러스)의 21쌍의 염기서열 중 18번째 염기 부위에 해당하는 박테리오파지(바이러스) DNA의 양쪽 가닥 모두가 절단된다.
이 연구 과정에서 다우드나와 카펜디어는 박테리오파지의 염기 서열은 21bp 길이로 잘려 크리스퍼 유전자(DNA) 내에 보관되었다가 세균이 다시 침입하면 전사되어 가이드 RNA로 사용되는데, 박테리오파지의 염기 서열이 아닌 다른 임의의 21bp 길이의 염기 서열을 크리스퍼 RNA에 연결하여 삽입해도 이 시스템이 정상적으로 작동하여 DNA를 절단하는 것을 확인하였다.
이러한 발견으로 크리스퍼는 기존의 효율성과 특이성이 떨어져 유전체에 사용하기 어려웠던 유전자 가위를 대치할 수 있는 새로운 유전자 가위가 되었다.
기존 유전자 가위들이 적게는 4개 많게는 12개 정도의 염기 서열을 인식하기에 유전체에 사용했을 경우 일치하는 부분이 많이 있을 수 있으므로 원하는 부분이 아니라도 같은 염기서열로 인식되어 절단되므로 오류 가능성이 높았다면, 크리스퍼는 21개의 염기 서열을 인식하기 때문에 유전체 내에서 21개의 염기 서열이 정확하게 일치하는 부분이 여럿일 가능성은 매우 낮다. 4의 21승 즉 4.4 × 10의 12승 종류의 유전자 가위가 가능하다. 그래서 크리스퍼의 경우 사람의 유전체에서 오류가 발생할 확률이 3.2 × 10의 9승을 4.4 × 10의 12승으로 나누면 1만 분의 7로 다른 유전자 가위 기술과 비교 불가능하게 그 오류 가능성이 낮아진다.  크리스퍼가 의도치 않은 부분의 유전자를 잘못 절단할 가능성은 거의 없다는 결론에 도달하게 된다. 제1, 2세대 유전자 가위는 인식하는 염기서열 수가 적어서 인식하는 염기서열 개수를 늘리기 위해 염기서열 여러 개를 붙여서 만드는데 어렵고 비용이 많이 들며 절단 부위가 많아 부정확하지만 크리스퍼는 작은 RNA로 DNA의 절단 부위를 정확히 찾고 제한효소로 그 부위를 절단하는 것이다. 그래서 과거 제1, 2세대 유전자 가위로는 유전자 하나를 잘라내고 새로 바꾸는 데 수개월에서 수년씩 걸리던 것이 크리스퍼를 통해 며칠이면 되고, 한 번에 여러 군데의 유전자를 동시에 처리할 수 있게 될 것이다. 게놈(유전체)에서 정확하게 원하는 부위를  잘라 내거나 원하는 다른 것으로 교체할 수 있는 도구를 찾게 된 것이다.
 현재 개발된 크리스퍼 카스 9 가위는 만능이 아니다. 이론과는 달리 실제에는 한 곳에서만 절단되기도 하지만 여러  곳에서 절단되고 있다. 그래서 먼저 정확성을 높여야 한다. 크리스퍼 카스 9 가위는 가위질에 서툰 사람처럼 원하지 않는 부위도 잘라낸다. 이를 '오프 타깃 사이트(off-target site)'라 부른다.
그리고 원치 않는 유전자 변이를 억제하는 연구도 앞으로 남은 중요한 과제이다.  
유전자를 절단하여 기능을 잃게 하는 것은 지금도 가능하지만 다른 유전자를 삽입하는 것은 더 많은 연구와 시간이 걸릴 것이다.
최근에는 크리스퍼 카스 9 가위의 원하지 않은 부분의 작용을 복구하는 스토퍼라고 하는 복구 효소를 찾았다고 하며 우리나라 공동연구진은 gRNA 끝에 구아닌(G) 염기를 하나 더 붙여 정확성을 높였다고 한다.
단백질인 CAS9 효소(한국:Cpf1효소)가 너무 크기 때문에 막을 통과하기가 어려워 크기가 작은 효소를 찾고 있는 중이다.
그리고 원조의 버클리대,  MIT,  우리나라의 김진수 박사가 이끄는  톨젠, IBS 등의 공동 팀 간에 특허권 분쟁이 일어나 소송이 벌어지고 있다.

8. 유전자 전달(遺傳子傳達, gene trasfer) 방법

가. 세균의 플라스미드(plasmid) 이용법
세균의 플라스미드(plasmid, 박테리아 등에 있는 본 염색체 외의 별도의 유전체)에 유전자를 연결시켜 운반하는 방법이다.

나. 인산칼슘 형질 주입(calcium phosphate trans-fection)
DNA-인산칼슘 용액을 배양세포에 넣으면 DNA-인산칼슘이 세포의 식세포 작용(食細胞作用, phagocytosis)에 의해 운반된다.

다. 유전자총 법(particle gun, Biolistic transformation)
핵산으로 도포된 금속입자를 가스압(력) 또는 자력(磁力)으로 세포 또는 조직에 주입시키는  방법이다.

라. 아그로박테리움(Agrobacterium, 토양 박테리아) 이용법
아그로박테리움은 식물의 상처 난 곳에 침입하며 Ti Plasmid(tumor inducing plasmid)라는 핵산 단백질 형태로 자신의 T-DNA((transfer DNA)를 식물체의 염색체에 삽입되는 것을 이용한다.

마. 프로토플라스트(protoplast) 이용법
식물세포의 세포벽을 제거하여 세포벽이 없는 상태(protoplast, 프로토플라스트)를 만들고 이 상태에서 원하는 DNA를 주입하여 유전자 변형 식물을 생성하는 방법이다.

바. 마이크로 피펫(micropipette) 이용법
마이크로 피펫(micropipette, 미세 피펫)을 사용하여 세포핵에 DNA를 주입하는 방법이다.

사. 바이러스 벡터(retrovirus vector) 이용법
유전자 치료를 위하여 레트로바이러스(retrovirus) 또는 아데노바이러스를 이용한 전달 시스템을 개발하였다.  
그런데 바이러스 벡터는 안전과 관련된 여러 문제점이 발견되었다.

아. 파열적 혈구(Ghost Red Blood Cell, Erythrocyte ghost-mediated gene delivery)  이용법
적혈구를 소변(urine)에 넣어 세포막을 파열시켜 세포막과 유리 헤모글로빈만 남은 파열적 혈구(Ghost red blood cell)에 전기천공으로 플라스미드 DNA을 삽입하여 혈액에 넣으면 혈액 세포를 표적으로 하는 유전자를 발현할 수 있다.

자. 리포솜 이용법(lipofection 법)  세포막과 구조가 같은 인지질 이중막을 만들어 그 속에 물질을 넣고 엔도시토시스(내포 작용)로 리포솜을 세포막에 융합시켜 물질을 세포 속으로 넣는다.

차. 전기천공법(electroporation)
세포막에 전기 충격을 주면 물질 투과성이 증대되어 몇 초에서 몇 분간 그 상태가 유지될 수 있으므로 직접 세포막을 투과할 수 없는 물질까지도 침투가 가능하게 된다.

타. 덴드리머(Dendrimer) 이용법
나뭇가지 모양의 고분자로 중심이 비어 있고 외부는 다양한 화학 단위와 반응할 수 있는 반응기가 존재하므로 주위의 건강한 조직을 다치지 않고도 원하는 의약을 감염 부위나 종양 부위에 선택적으로 전달할 수 있어 유전적 결함을 치료하는 데 사용된다.
그중에서 양이온성 고분자의 일종인 가지형 폴리에틸렌이민(BPEI)은 화학적 수정이 쉽고 뛰어난 유전자 전달 능력을 갖추고 있으므로 전도 유망한 비 바이러스성 전달체로 간주하고 있다.

카. TAT protein(Trans-Activator of Transcription) 이용법
Human immuno deficiency virus(HIV, 에이즈 바이러스)에서 유래된 TAT protein은 단백질을 세포 내로 침투시키는 능력이 있다고 알려져 있다. 정확한 기작은 아직 밝혀진 바 없지만 receptor나 transporter에 의존하지 않고 직접 세포막에 작용하여 세포 내로 침투한다고 추정되고 있다. TAT protein 전체나 특정 부분이 ovalbumin, horse radish peroxidase, beta-galactosidase 등의 단백질뿐만 아니라 nucleic acld, nano particle, liposome과 같은 고분자 물질을 세포 내로 침투시킬 수 있음이 여러 연구자들의 실험을 통해 입증되었고, 따라서 이와 같은 시도들은 세포 내 단백질 침투 기술을 이용한 질병 치료의 가능성을 제시하였다. Protein transduction domain을 생리 활성이 뛰어난 목표 단백질에 재조합 단백질 제조기술을 이용하여 융합하고 세포나 조직 내로 침투시켜 질병의 치료나 특정 증상의 완화를 목표로 하는 시도는 다양한 단백질에 transduction domain을 적용할 수 있다는 연구결과에 의해 그 가능성이 더욱 증가하였다.

9. 유전자 가위(크리스퍼 카스 9) 적용 사례

 크리스퍼 카스 9 가위 하나를 만드는 비용은 1000달러에 불과하다. 저렴한 만큼 연구가 여러 곳에서 많이 이루어져 발전 속도가 빠르고 응용분야도 넓다. 고부가가치 농작물이나 줄기세포를 활용한 유전자 치료 등에서도 관련 연구가 진행되고 있다.

가. 피가 응고되지 않는 혈우병을 치료하기 위해 혈우병 환자  본인의 돌연변이 세포를  이용해 역분화 줄기세포(iPS)를 만든 뒤 혈우병을 일으키는 원인 유전자를 ‘유전자 가위’로 교정, 정상적인 세포로 분화시켜 혈우병에 걸린 쥐에 이식해 생존기간을 늘리는 데 성공했다.

나. 중국 광저우 의대에서는 수정란에 ‘유전자 가위’ 기술을 적용해 에이즈 바이러스(HIV)에 내성을 갖는 배아를 만들었다. 26개의 인간 배아에 유전자 가위 기술을 활용해 혈액세포 유전자(CCR5)를 제거하는 데 성공했다. CCR5는 에이즈 바이러스(HIV)와 달라붙어 세포 속으로 HIV 바이러스를 이동시키는 역할을 한다. 이 때문에 CCR5를 제거하면 HIV에 감염되지 않는다.
에이즈 환자를 치료하는 것이 아니고 태어나는 아기에 적용해 본 거이다. 이것도 성공할지는 기다려 보아야 한다.

다. 한미 합동 연구팀은 면역결핍 형질전환 복제돼지를 생산하는 데 성공했다. 이번에 개발된 돼지는 ‘유전자 가위’를 이용해 면역 관련 유전자를 완전히 제거시킨 형질전환 복제돼지로, 인간과 매우 유사한 면역체계를 가지고 있어 줄기세포 치료 때 세포치료의 안전성, 만능성, 분화 가능성을 조기에 확인할 수 있어 치료 성공률을 높일 수 있다.

라. 영국에서는 크리스퍼 카스 9 기술을 이용해 돼지의 감염과 관련된 유전자를 흑 멧돼지의 유전자로 교체해 아프리카 돼지의 열병을 치료하였다.

마. 호주에서는 달걀 알레르기를 해결하기 위해 크리스퍼 카스 9를 활용했다. 닭의 원시 생식세포(정자나 난자 어느 쪽으로도 변할 수 있는 미성숙 세포)를 수정할 수 있는 방법을 개발해 알레르기를 없앤 달걀의 개발 가능성을 열었다.

바. 유전자 조작 식품(GMO)의 유해성 논란도 줄어들 것이다. 현재 만들고 있는 GMO는 식물 세균인 ‘아그로박테리움’을 활용해 외부 유전자를 식물에 인위적으로 삽입하는 유전자 재조합 방법을 이용한다. 이 과정에서 목표로 하는 유전자뿐만 아니라 수백, 수천 개가 넘는 외부 유전자가 같이 삽입돼 안전성 문제가 생길 수 있다.
유전자 가위에 쓰이는 RNA는 오직 목표 DNA에만 상보적으로 결합해 불활성화시키므로 정확성 또한 뛰어나다. RNA를 도입한다는 점에서 GM 기술과 달리 세포 내 DNA가 잔류 할리도 만무하다. 때문에 ‘유전자 가위’는 GMO의 부작용을 최소화할 수 있다.  

사. 멸종 동물들의 복원에도 연구가 진행되고 있다. 미국 하버드 의대 연구진이 이끄는 연구진은 인도코끼리를 변형해 추위에서도 잘 살아남는 코끼리를 만든 뒤 시베리아에 방출할 계획을 세우고 있다.
미국 캘리포니아대에선 19세기에 소멸된 여행 비둘기를 부활시키기 위해 박물관에 보관된 여행 비둘기의 DNA와 현대 비둘기의 DNA를 비교하는 작업이 진행 중이다.

10. 윤리적 논쟁

 유전자 가위를 활용한 유전자 조작 기술이 발전함에 따라 생명윤리에 대한 우려도 함께 커지고 있다.
황쥔주 등 중산대 연구팀은 인공 수정란의 빈혈 유발 유전자를 정상 유전자로 바꿔치기했다고 발표해 일부 과학자가 ‘크리스퍼 카스 9 연구 중단(모라토리움)’ 선언을 촉구하는 등 논쟁을 일으켰다.
 미국 재생의학을 위한 연합 의장인 에드워드 랜피어 박사 등 네 명의 저명한 과학자는 유전자 가위를 활용한 인간배아 연구를 중단해야 한다고 네이처(Nature)지 기고를 통해 밝혔다. 미국 노벨상 수상자인 데이비드 볼티모어와 폴 버그 박사는 최근 월스트리트 저널(WSJ) 기고에서 “과학계가 기술과 윤리적 차원에서 우리 행동의 신중하게 생각해야 한다"라며 “지금은 유전자를 편집하기 전에 잠시 멈춰 생각할 시간”이라고 호소했다. 저명한 생화학자이자 국제줄기세포 연구 학회(ISSCR) 회장인 루돌프 재니쉬도 타임 기고를 통해 이 같은 움직임에 동참했다.
 우리 정부도 국가 과학기술심의회에서 사람을 대상으로 한 치료에 유전자 가위를 적용하기 위해서는 추가 연구와 안전성에 대한 검증이 필요며 인간 배아에 유전자 가위를 적용하는 문제에 대해서도 사회적 합의를 모으기로 하는 등 유전자 연구에 크리스퍼 카스 9를 사용하는데 소극적이다.

11. 각 국 정부의 허가 사항

2006년 유럽연합(EU)은 유전자 편집 염소를 이용해 항응고 단백질이 포함된 우유 생산을 허가했으며, 2009년 미국 식품의약국(FDA)도 이를 허가했다. 양 기관은 지난해 콜레스테롤 약물에 유전자 편집 닭이 생산한 달걀을 포함하는 것을 허가하기도 했다.
인간의 수정란에서 유전자 일부를 잘라내고 편집하는 실험이 영국에서 승인됐다. 국가기관의 승인을 받아 공식으로 실험하는 것은 이번이 처음이다.

유전자 가위, 크리스퍼(CRISPR)카스9(Cas9).hwp

유전자 가위, 크리스퍼(CRISPR)카스9(Cas9).hwp

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