DNA 염기서열 분석법(DNA 시퀀싱, DNA sequencing), 디-데옥시 법(Dideoxy Sequencing, 다이 데옥시 시퀀싱)

DNA 염기서열 분석법(DNA 시퀀싱, DNA sequencing), 디-데옥시 법(Dideoxy Sequencing, 다이 데옥시 시퀀싱, Sanger 법, 생어법)

김진국

 DNA의 염기서열(염기-데옥시 뉴클레오티드가 결합한 순서)을 읽어 내는 것을 DNA 시퀀싱(DNA sequencing)이라고 한다.
 
1. 디-데옥시 법(Dideoxy Sequencing, 다이 데옥시 시퀀싱, 디디옥시 법)

 프레더릭 생어(Frederick Sanger, 1918 ~ 2013, 영국)에 의해 1977년에 개발되었으며 Sanger 법이라고도 한다. 월터 길버트(Walter Gilbert, 1932 ~, 미국)는 제한효소(Restriction endonucleases, 제한 핵산 내부 가수분해효소, restriction endonuclease)로 처리하여 염기서열을 다른 방법으로  분석하였다.

가. 원리

 디-데옥시 법(Dideoxy Sequencing, 다이 데옥시 시퀀싱)은 PCR 법과 전기영동(電氣泳動,  Electrophoresis) 법을 이용한다. 염기서열을 분석하려는 DNA를 PCR 법으로 복제하는 과정에서 새로 합성되는 DNA 가닥이 특정 데옥시리보뉴클레오타이드(A, T, G, C 중의 하나)에 이르면 중합이 중단되도록 하는 반응 조건을 이용하는 것이다.
정상적인 DNA 복제 과정에서  일어나는 중합 반응은 먼저 중합된 데옥시리보뉴클레오타이드(dNMP)의 3'-OH 기에 다음 데옥시리보뉴클레오타이드(dNMP) 5'의 인산기가 결합한다.
그런데 3'-OH 기가 없는 디-데옥시리보뉴클레오시드 삼인산(ddNTP,3'-OH 자리에 3'-H)을 사용하면 3'-OH 기가 없으므로 다음 디-데옥시리보뉴클레오시드 삼인산(dNTP)은 더 이상 중합이 진행되지 않는다.  즉 데옥시 리보스의 3번 탄소에 결합한 수산기가 없는 뉴클레오시드 삼인산을 사용함으로써 3'으로의 중합이 불가능하게 된다. 그런데 A의 위치를 알아내기 위해 특정한 디-데옥시리보뉴클레오시드 삼인산(ddATP)만 사용한다면 첫 번째 A 자리에 ddATP가 결합되면 중합이 바로 끝나므로 첫 번째 A 위치 밖에 알 수 없다. 그래서 모든 A의 위치를 알아내기 위해서는 A 염기 중에 대부분은 dATP이고 일부만 ddATP을 혼합하여 넣는 것이다. dATP와 ddATP가 혼합되어 있으면 ddATP가 결합되어 중합 반응이 끝날 수도 있고 dATP가 결합되어 중합이 계속될 수도 있다. 다음 A에서도 같은 확률이 된다. 이와 같이 혼합하여 PCR 법으로 여러 번 복제하면 A로 끝나는 모든 DNA 조각을 생성할 수 있는 것이다.
T,  G,  C도 같은 방법으로 각각의 조각을 합성하여 전기영동으로 분리하고 그 위치로 염기서열을 결정하는 것이다.

나.  다이 데옥시 법으로 DNA 복제 

 PCR 법으로 DNA를 복제하는 방법을 이용한다.
DNA 염기배열 순서를 분석하는 방법은 다음과 같다.
 그런데 PCR 법으로는 긴 DNA 전체를 한 번에 북제를 할 수 없다. PCR 법으로는 10 kbp(1만 개의 염기, 1 kbp=1 kilo base pairs=1,000bp, bp=염기쌍) 정도 가능하지만 일반적인 경우 1~2 kbp를 넘지 않는다. 그래서 긴 DNA을 짧게 절단하여 짧은 DNA을 만들어 이용한다.

1) DNA 중합 효소를 이용하여 DNA 시료의 부분적인 복제물을 만든다.

2) DNA 절편의 염기서열을 결정하기 위하여 이중나선의 DNA는 먼저 두 개의 단일 나선으로 분리되어야 하고, 둘 중 하나의 단일 나선(ssDNA, 단일 가닥 DNA)을 서열 결정을 위한 주형으로 사용된다. 단일 가닥 DNA(ssDNA)는 2중 나선 구조의 DNA에 열이나 알칼리로 처리하여 만든다.

3) 단일 가닥 DNA와 DNA 중합 효소(Taq DNA polymerase), 복제의 시작에 필요한 프라이머 DNA, 네 가지 데옥시 뉴클레오시드 삼인산 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)를 넣은 4개의 실험구를 준비한다.

4) 네 가지 디-데옥시 뉴클레오시드 삼인산(ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)을 준비하여 자외선을 쪼이면 형광을 발하는 염색 물질로 염색한다.

5) 데옥시 뉴클레오타이드 4가지 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)을 넣어 준비한 4개의 실험구에 4가지 디-데옥시 뉴클레오타이드(ddNTP) 중 한 가지를 넣는다.
4종류의 뉴클레오티드 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)에 소량의 ddNTP를 포함시키면, 많은 양의 정상적인 dNTP와 경쟁하므로 ddNTP는 합성되는 DNA에 가끔 삽입하게 된다.
  이 디-데옥시리보뉴클레오시드(ddNTP)가 중합되면 디-데옥시리보뉴클레오시드(ddNTP)는 3'-OH가 없기 때문에 더 이상 중합이 일어나지 않게 되어 중단되게 된다.
예를 들어 4종류의 뉴클레오티드 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)에 소량의 ddATP를 포함시키면, 많은 양의 정상적인 dATP와 경쟁하므로 ddATP는 합성되는 DNA에 가끔 삽입하게 된다. 그 결과 분석하려는 DNA 절편 가닥의 염기서열 중 처음부터  모든 A 염기가 결합된 곳까지만 복제가 일어나게 되는 것이다.
 이러한 반응은 결과적으로 합성되는 DNA는 길이가 다르지만 모두 A에서 끝나게 된다.
다른 실험구에도 각각 소량의  ddCTP,  ddGTP,  ddTTP 넣어 반응시키면 된다.

6) 단일 가닥 DNA와 DNA 중합 효소(Taq DNA polymerase), 복제의 시작에 필요한 프라이머 DNA, dNTP, ddNTP를 넣은 실험구를 PCR 법으로 증폭(복제) 한다.
 이 실험구를 가열하면 DNA 두 가닥 사이의 수소결합이 분해되고 식히면 푸라이머가 붙고 이어서 온도를 조금 높이면 연속적으로 중합 반응이 일어나 증폭(복제)되므로 가열했다 식히기를 계속 반복하면 된다. 그리고 증폭(복제) 될 때마다 처음 주형으로 사용한 1가닥의 단일 가닥 DNA만 증폭(복제) 된다. 새로 증폭된  단일 가닥 DNA는 그 가닥에 맞는 프라이머 DNA를 넣지 않았기 때문에 다시 증폭(복제) 될 수 없다. 그래서 수백 번이라도 처음 DNA 가닥 만을 주형으로 하여 복제되는 것이다.
중합 반응에 필요한 에너지는 dNTP의 인산이 분해되어 dNMP로 될 때 발생하는 에너지가 이용된다.

7) 복제된 네 가지 실험구 반응 생성물을 폴리 아크릴아미드 겔을 이용한 전기영동 법으로 각각 4개의 레인에서 분리한다.  약산성인 핵산은 (-) 전하를 띠므로 전기영동 장치의 (-) 극 쪽 폴리 아크릴아미드 겔의 홈에 넣어 (+) 극 쪽으로 전개시킨다.
각 레인에서 밴드는 주어진 디-데옥시 뉴클레오타이드가 끝으로 합성되어 중합이 끝난 DNA 절편을 나타낸다.

8)  레인의 모든  밴드를 종합해서 가장 멀리 이동(전기영동 장치의 +극, anode) 된 밴드부터 시작해서 처음 시발점 쪽(전기영동 장치의 -극, cathode)으로 밴드 위치를 차례대로 읽으면 주형 DNA의 염기서열을 결정할 수 있다.
즉 4개 레인의 분리된 모든 밴드를 자외선을 쪼여서 나타나는 각각의 형광색에 대응하는 A, T, G, C로 치환하고 이 A, T, G, C 밴드를 길이가 짧은 것(+극 쪽, anode)에서 긴 것(-극 쪽, cathode)의 순으로 나열하면  5'→3'방향의 염기서열이 확정되는 것이다. 이렇게 확정된 염기서열은 주형으로 사용한 단일 가닥의 DNA 염기서열이 아니고 상보적인 가닥의 염기서열이다.
그래서 이 염기서열을 상보적인 염기로 치환하면 주형으로 사용한 단일 가닥 DNA의 3'→5'방향의 염기서열이 된다.


2. DNA 염기서열을 판독하는 최신의 방법

 유진 첸(Eugene Chan)이 설립한 US 지노믹스(US Genomics, 주, 1997년, 미)는 혈액세포 중 핵이 있어 분열이 가능한 백혈구 세포를 이용하는데 세포분열 주기 상에서 DNA 복제가 이뤄지기 직전 상태인 세포를 고정시켜 DNA를 추출한 다음 각각 다른 색의 형광물질로 염색한 네 가지 염기인 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 넣어 복제한다. 이렇게 복제되는 DNA는 한쪽에만 염색된 염기가 붙은 이중 나선을 만든다.
이 DNA 나선을 깔때기 형태의 좁은 구멍을 통과시키는 데, 그 내벽에는 색깔별로 다른 형광물질을 알아내는 센서가 내장되어 있다. 이 구멍은 DNA 한 가닥 정도가 지나갈 수 있을 정도로 좁게 만들어져 있다. 그래서 '나노채널'로 불린다.
즉 DNA 나선이 그 구멍을 지날 때 센서는 색깔별로 어떤 염기인지를 감지할 수 있도록 되어 있어 그 정보를 컴퓨터로 보내어 염기배열 순서를 판독하도록 되어 있다. 이 방법은 DNA를 여러 조각으로 자르거나 증폭시킬 필요가 없어 매우 빠르게 염기배열 순서를 판독할 수 있다.

* 단일 세포 시퀀싱(Single cell sequencing)

한 개체의 세포들은 동일한 유전체를 가지는 것으로 알려져 왔으나 계속된 연구를 통해 작은 세포 집단에서 환경의 변화로  차이가 있다는 것이 암 환자 등에서 발견되었다.
특정한 개별 세포의 DNA가 달라지거나 전사된 RNA가 다름에 따라 번역된 단백질이 다를 수 있다는 것이다. 이 같은 차이를 이용하여 암 연구, 줄기세포, 면역학, 발생학, 신경학 분야에 새로운 접근이 가능하게 되었다.
그래서 특정한 세포의 유전체(DNA, RNA)를 PCR로 증폭하여 시퀀싱 (sequencing) 하는 것을 단일 세포 시퀀싱 (Single cell sequencing)이라 한다.
특히 암세포를 죽이는 항암 mRNA, 코로나19 예방을 위한 항원 mRNA 등이 개발되고 있다.
mRNA는 바로 PCR이 불가능하므로 역전사효소를 이용하여 mRNA를 역전 사하여 DNA로 합성한 다음 PCR로 증폭한다.
이렇게 생성된 mRNA는 불안정하므로 마이크로플루이 딕스(Microfluidices) 기술로 mRNA를 안정화시켜 대량 생산할 수 있게 되었다. 마이크로플루이딕스(Microfluidices)란 지질 입자로 만든 일종의 극히 작은 마이셀(micelle) 속에 불안정한 mRNA를 1개씩 넣어 넣어 안정화시키는 것이다.

* 마이크로플루이딕스(Microfluidices) 기술

mRNA + LNP(Lipid nanoparticle,  구성요소
Ionlizsble lipid, DSPC, PEG lipids, Cholesterol) → 미세관 속으로 통과시킴(Microfluidices 장치) → LNPs(안정화된 mRNA)

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