PCR(polymerase chain reaction, 중합효소연쇄반응, DNA 증폭, 실험실에서의 DNA복제)

PCR(polymerase chain reaction 중합효소 연쇄반응)은 실험실에서 DNA 분자 중에서 원하는 부분을 복제하여 증폭하는 방법이며 1985년, 캐리 멀리스(K. B. Mullis, 1944 ~ , 미국)가 개발하였다.
PCR는 DNA 중에서 프라이머(primer)가 결합하여 복제가 시작되는 2개의 복제원점(Replication Origin) 사이의 DNA 부분을 대량으로 복제할 수 있다.

그래서 DNA 분자에서 증폭하고자 하는 부분의 경계지점에 있는 염기서열(border sequence, 시작 지점과 끝 지점의 염기서열)만 알 수 있으면 실험실에서 단시간 내에 필요한 DNA 부분을 복제하여 엄청난 양으로 증폭시킬 수 있다. 현재 기술로는 큰 DNA를 한 번에 PCR 법으로 복제하는 것은 불가능하고  2 kbp(2,000 염기, 2 killo base pairs) 정도를 복제할 수 있다.
 DNA의 염기서열 등 정보를 알아 내기 위해서나 이용하기 위해서는 같은 종류의 DNA 양이 상당이 많이 필요하다. 그래서 DNA의 염기서열을 파악하는 작업을 할 DNA가 양이 적다면 DNA을 복제하여 양을 증폭할 필요가 있다.  
 그 원리는 DNA는 두 가닥이 수소결합으로 붙어 있는데  DNA에 열을 가하면(80℃ 이상) DNA에 있는 두 가닥 간의 수소결합이 분해되어 1가닥씩으로 분리된다(double helix → single strand).
이와 같이 DNA가 열에 의해 두 가닥으로 분리되는 것을  DNA가 변성(denature) 되었다고 하며, 다시 열을 낮추면(50℃) 두 가닥 사이에 수소결합이 일어나 두 가닥이 결합된 DNA로 복구된다. 이런 성질을 이용하여 필요한 DNA 복제를 실험실에서 할 수 있다.
 이 실험에는 DNA polymerase라는 중합 효소가 작용해야 하는데  50 ～ 95℃에서 보통의 DNA polymerase(중합 효소)는 변성되어 작용할 수 없으므로 실험이 불가능하다. 그래서 Thermus aquaticus(호열 균, 초고온에 견디는 고세균의 일종) 등과 같은 초고온균의 내열성 중합 효소(Taq DNA polymerase) 유전자를 추출해 대장균의 플라스미드(plasmis)에 재조합시켜 고온에서도 쉽게 변성되지 않는 Taq DNA polymerase(내열성 중합 효소)를 대량으로 생산하여 공급함에 따라 이 실험이 가능하게 되었다.
 PCR 과정은 변성(denaturation), 열처리(annealing), 연속적으로 복제되는 과정(extension)의 세 단계로 되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. PCR에 필요한 요소에는 DNA template(DNA 주형), DNA의 두 가닥에 각각 결합할 두 가지의 DNA  프라이머(DNA primer), 디옥시뉴클레오티드(dNTP), polymerase(중합 효소) 등이 있으며, PCR 과정에서 그것의 sensitivity와 accuracy에 가장 영향을 미치는 것은 DNA primer와 온도(temperature)이다.
 
1. PCR에 필요한 요소

가. DNA 중합 효소(DNA polymerase)

  DNA 중합 효소(DNA polymerase)는 Thermus aquaticus(초고온에 견디는 고초균, 온천이나 깊은 바다의 열수에 생존)에서 추출하며 72℃ 정도에서 최고의 활성도를 보이고 50 ～ 95℃의 온도 변화에도 안정성을 보인다.
 Taq DNA polymerase는 1965년 토마스 D. 브록(Thomas Dale Brock, 1926~ , 미국)이 고도 호열 균(thermophilic bacterium)인 더무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)에서 분리하였으며 균에서 이름을 따왔다.

나. 프라이머(DNA primer)

 프라이머(DNA primer)는 2종류를 이용하며 Template DNA(주형 DNA) 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA 단편의 양쪽 끝이 3'인 가닥의 끝에 있는 약 18 ~ 22bp(base pairs, 염기쌍) 내외의 염기서열에 대응하는 18 ~ 22개의 뉴클레오타이드로 구성된 단일가닥의 DNA(oligonucleotide)이다. 프라이머(DNA primer, 18 ~ 22bp 내외의 oligonucleotide)가 Template DNA(주형 DNA) 가닥에서 증폭하고자 하는 유전자 앞쪽에 있는 약 18 ~ 22bp 내외의 뉴클레오타이드에 수소 결합하면 새로운 뉴클레오타이드의 인산기가 먼저 결합한 프라이머의 C3'-OH 기에 공유결합으로 중합 반응을 하게 되며 이어서 새로운 뉴클레오타이드의 중합 반응이 계속 일어나게 된다. Template(주형) DNA 가닥에 프라이머(DNA primer)가 먼저 결합하지 않으면 새로운 뉴클레오타이드의 상보적 중합 반응이 일어나지 않는다. 프라이머는 시작점을 찾는 역할을 하며 뉴클레오타이드가 중합할 수 있는  C3'-OH 기를 제공하기 때문이다. 프라이머(DNA primer)는 온도와 함께 PCR의 accuracy(정확도)를 결정짓는 중요한 요소이다.
 
다. 데옥시뉴클레오타이드 
  
DNA를 구성하고 있는 데옥시뉴클레오타이드는 데옥시뉴클레오시드 1인산(dNMP ; dAMP, dGMP, dTMP, dCMP)이다. 그런데 실험에서 네 종류의 데옥시뉴클레오타이드 재료로  dNMP(dAMP, dGMP, dCMP, dTMP)를 이용하지 않고 dNTP(디옥시뉴클레오시드 3인산,  dATP, dGTP, dCTP, dTTP)를 이용한다.
이것은 디옥시뉴클레오시드 3인산(dNTP)은 중합 과정에서 먼저 2개의 인산이 분해되며 이때 발생한 에너지로 dNMP(디옥시뉴클레오시드 1인산)의 인산이 먼저 앞에 결합된 디옥시리보오스 3`-OH에 약하게 중합 반응을 하기 때문이다.
새로운 DNA 가닥을 만드는데 필요한 DNA 구성 물질인 네 종류의 디옥시뉴클레오타이드(deoxyribonucleoside triphosphates, dATP, dGTP, dCTP, dTTP)를 형광물질로 표지하여 염기서열을 판독 가능하게 한다.
 
2. PCR 과정

가. 풀림 작용(Denaturation, 변성, DNA를 두 가닥으로 분리)

 PCR의 가장 첫 단계로, 복제할 DNA fragments(조각), Taq DNA polymerase(호열균의 내열성 중합 효소), 프라이머(DNA primer), 데옥시뉴클레오타이드(deoxyribonucleoside triphosphates, dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 혼합 용액을 만든다.
deoxyribonucleoside triphosphates(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)를 합성할 때 각 데옥시뉴클레오타이드를 형광물질로 표지하여 공급하므로 PCR 과정으로 복제된 DNA를 컴퓨터로 판독하면 DNA의 sequencing(염기서열 등을 파악하는 작업)을 할 수 있다.
 이 혼합액을 95℃ 정도 가열하여 복제할 DNA fragments(조각)의 두 가닥 간의 수소결합을 분해하여 2개의 가닥으로 분리시킨다. → DNA가 denature 됨(double helix → single strand)
이 과정으로 DNA는 두 가닥으로 분리된다. 이것은 온도가 높아짐에 따라 DNA의 염기 사이에 있는 수소결합이 끊어지기 때문이다. 일반적으로 94℃ 정도에서 1분간 진행된다.
 
나. 결합 작용(Annealing)

 각각 두 가닥으로 분리된 DNA 분자에 프라이머(DNA primer)가 붙는 과정이다. 94℃에서 다시 온도를 50℃로 낮추면 프라이머(DNA primer)가 각  DNA 가닥에 결합한다. 프라이머(DNA primer)는 그들과 상보적인 염기를 가지고 있는 DNA 서열에 달라붙는다. 이 과정이 바로 PCR의 accuracy(정확도)를 결정짓는 단계이며, 어느 온도로 진행되는 가는 프라이머(DNA primer)의 길이와 그것을 이루고 있는 염기의 종류에 따라 달라진다. 만약에 온도가 너무 높으면 프라이머(DNA primer)가 DNA 분자에 잘 결합되지 않아 그 효율이 떨어지며, 반대로 온도가 너무 낮을 경우에는 프라이머(DNA primer)가 잘 못 결합할 확률이 높아서 정확도가 그만큼 더 떨어진다.
 
다. 복제가 연속되는 과정(Extension)

 프라이머(DNA primer)에 데옥시뉴클레오타이드가 중합 반응이 시작되어 DNA의 복제가 계속되는 과정이다.
  프라이머(DNA primer)가 주형에 결합된 다음 74℃로 온도를 높이면 용액 속에 넣어준 데옥시뉴클레오타이드(deoxyribonucleoside triphosphates, dATP, dGTP, dCTP, dTTP)가 분리된  DNA의 각 가닥에 polymerase(중합 효소)의 작용에 의해 상보적으로 프라이머(DNA primer)의 3'쪽에 뉴클레오타이드의 5'쪽이 결합하여(5'→3' 방향으로 진행) 각 가닥은 다시 두가닥으로 된다. 이때는 보통 74℃에서 2분간 진행되며, 이 온도가 Taq polymerase(내열성 중합 효소)의 활성이 최대로 되는 온도이다.
위의 과정을 한차례 거치면 DNA 조각이 2배로 된다.
 따라서, PCR cycle(each cycle: 5 min)을 20회 실시한다면, DNA 증폭은 220 = 1,048,576/100 min 배로 형성된다.  
 
3. PCR의 응용

가. 소량의 DNA로 대량의 DNA를 만들고자 할 때

 PCR의 가장 대표적인 응용분야는 소량의 DNA를 증폭시켜 대량으로 만드는 것이다. 아주 소량만 있어도 대량으로 증폭할 수 있기 때문에 범인의 흔적만 찾아도 조사에 활용할 수 있고, 고고학이나 고생물학에서도 화석으로 남아있는 고대 생물들의 조그마한 DNA 부분으로 DNA 염기서열을 파악(sequencing) 할 수 있다.
이뿐만 아니라 virus(HIV 등)의 DNA 염기서열을 파악할 수 있어 의학, 유전공학, 분자생물학 등에 PCR 방법이 활용될 수 있다.

나. 유전병 진단

 유전병을 진단하기 위해서는 돌연변이 유전자의 염기서열을 파악해야 하는데 PCR를 사용하면 유전자의 염기서열을 짧은 시간 내에 정확하게 할 수 있다. 질병 진단뿐만 아니라, 바이러스 유전자의 염기서열을 알아냄으로써 질병의 원인이나 치료를 연구하는데도 많이 이용된다.
 
4. PCR의 종류

가. RT-PCR(reverse transcription  PCR)

 RT-PCR(reverse transcription  PCR)은 PCR의 주형(template)으로 mRNA를 사용하기 때문에 세포 내에 mRNA가 얼마나 존재하는 가를 알아낼 수 있으며. 이것으로 세포내에서 어떤 유전자가 얼마나 발현되는 가를 알 수 있다.

나. RAPD (random amplified polymorphic DNA) PCR

 RAPD (random amplified polymorphic DNA) PCR은 두 생명체의 유전학적 유사성을 알아내는 데 사용한다. PCR 실행 중에 primer가 짧으면 주형 DNA 상에 여러 곳에 primer가 붙을 수 있으므로 여러 개의 DNA fragment를 만든다. 이 fragment들을 전기영동으로 분리하면 생명체마다 특별한 band가 나타나므로 이것으로 생명체 간의 유사성을 알아낼 수 있다. 그리고 RAPD PCR은 방법이 비교적 간단하고 쉽워 genome sequencing을 하기 전에 대략적인 종간의 관계를 알아낼 수 있다.

다. DDRT-PCR(Differential Display Reverse Transcription  PCR)

 DDRT-PCR(Differential Display Reverse Transcription  PCR)는 서로 다른 세포에서 RNA를 분리하여 특정한세포에서 특이적으로 발현되는 mRNA를 찾아내는 목적으로 한다. 시료 RNA를 T 염기 10개와 비특정 염기 2개가 연결된 oligonucleotide를 primer로 이용하여 역전사효소(reverse transcriptase)로 cDNA(상보적 DNA, complementary DNA)를 합성한 후 T 염기 10개와 비특정 염기 2개가 연결된 oligonucleotide의 primer와 비특정 염기서열을 지닌 oligonucleotide의 primer로 이용하여 PCR을 하였을 때 나타나는 여러 가지 PCR 산물을 비교함으로써 서로 다른 세포로부터 증폭된 PCR 생성물에 차이가 있는지 없는지를 확인하는 방법이다.
 그 외에도 PCR for DNA sequencing, SSCP(Single strand conformation polymorphism), RACE(Rapid amplification of cDNA ends), ISPCR(in silico PCR) 등의 여러 가지 응용법이 있으며 PCR의 단점을 보완한 LA PCR 법도 개발되었다(LA=long and accurate).

PCR(DNA 증폭, 중합연쇄반응, 실험실DNA복제).hwp

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